【人外周血单核细胞 PBMC分离及培养】在免疫学、细胞生物学及相关生物医学研究中，人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）是重要的研究对象。PBMC 包括淋巴细胞（如 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞）以及单核细胞，具有广泛的应用价值，例如用于免疫应答研究、疫苗开发、肿瘤免疫治疗等。因此，掌握 PBMC 的分离与培养方法对于相关实验至关重要。
一、PBMC 分离的主要步骤
PBMC 的分离通常采用密度梯度离心法，利用 Ficoll 或 Percoll 等密度介质将血液中的不同成分分层，从而获得富含 PBMC 的细胞层。以下是主要操作流程：
| 步骤 | 操作内容 | 注意事项 |
| 1 | 取静脉血 5~10 mL，加入抗凝剂（如肝素或 EDTA） | 血液需新鲜，避免溶血 |
| 2 | 将血液与等体积的 PBS 混合稀释 | 保证细胞活性 |
| 3 | 将混合液缓慢加到预铺好的 Ficoll 液面上 | 避免剧烈震荡，防止界面破坏 |
| 4 | 进行离心（300~400 g，30 min，无刹车） | 温度控制在 20~25℃ |
| 5 | 收集界面处的 PBMC 层，用 PBS 洗涤 | 去除残留的红细胞和粒细胞 |
| 6 | 重悬细胞，进行计数和活力检测 | 使用台盼蓝染色法 |
二、PBMC 的培养方法
分离后的 PBMC 需要在适宜的培养基中进行体外培养，以维持其功能和活性。常用的培养基为 RPMI-1640 或 DMEM，并添加胎牛血清（FBS）、抗生素等成分。
| 培养条件 | 参数说明 | 目的 |
| 培养基 | RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 抗生素 | 提供营养与生长因子 |
| 温度 | 37℃ | 维持细胞代谢 |
| CO₂浓度 | 5% | 保持 pH 稳定 |
| 培养时间 | 24~72 小时 | 根据实验需求调整 |
| 添加物 | IL-2、PHA 等刺激因子 | 激活或扩增特定细胞亚群 |
三、注意事项与常见问题
在实际操作过程中，需要注意以下几点：
1. 血液采集后尽快处理，避免细胞死亡。
2. 离心速度和时间需严格控制，否则会影响细胞回收率。
3. 洗涤步骤要彻底，减少杂质对后续实验的影响。
4. 培养过程中注意无菌操作，防止污染。
5. 细胞活性检测是评估实验成功与否的重要指标。
四、总结
人外周血单核细胞（PBMC）的分离与培养是基础免疫研究的重要环节。通过合理的实验设计与操作流程，可以有效获取高纯度、高活性的 PBMC，为后续的功能研究提供可靠的细胞来源。同时，实验人员应注重细节操作，提高实验成功率与数据可靠性。
表：PBMC 分离与培养关键信息汇总
| 项目 | 内容 |
| 细胞类型 | 单核细胞、T 细胞、B 细胞、NK 细胞 |
| 分离方法 | 密度梯度离心法（Ficoll/Percoll） |
| 主要试剂 | Ficoll、PBS、RPMI-1640、FBS、抗生素 |
| 培养条件 | 37℃, 5% CO₂, 24~72 h |
| 质量控制 | 细胞计数、活力检测（台盼蓝法） |
以上内容为基于实验操作经验整理，旨在为相关研究者提供参考。
